张力勤团队创建响应型分子探针功能筛选平台
近日, 北京大学药学院天然药物及仿生药物全国重点实验室张力勤研究员在国际学术期刊Nature Biomedical Engineering上发表了题为“Systematic functional screening of switchable aptamer beacon probes”的研究论文, 开发了一种系统性的功能筛选平台, 用于快速制备可变构的适体信标探针(switchable aptamer beacon probes)。这项技术旨在解决传统免疫检测方法中操作繁琐、准确性差、难以实现实时动态观测的瓶颈, 为生命科学研究和医学诊断提供了新一代强大工具。
免疫分析技术在分子生物学研究和医学诊断中具有核心作用, 抗体和适体等亲和分子已被广泛用作识别单元。然而, 基于这些亲和力探针的分析方法往往依赖于多步清洗, 操作复杂且容易引入误差, 尤其在细胞内环境或微流控体系中难以实现高效应用。因此, 人们越来越关注开发用于免洗检测的分子探针, 开发能够在结合靶标时直接产生活性信号、无需清洗的新型分子探针成为研究热点。本研究基于核酸适体可编程性与易修饰性, 构建了一种具有发夹结构的分子信标库。该信标在茎部两端分别标记荧光基团(Cy3)与淬灭基团(BHQ1), 初始状态下因荧光共振能量转移(FRET)而处于荧光猝灭状态。当与靶蛋白结合时, 信标发生构象变化, 茎环打开, 荧光恢复, 从而实现“信号开启”式检测。
研究团队采用微珠展示技术, 通过乳化PCR在磁珠表面构建单克隆DNA文库。利用限制性内切酶Sal I进行位点特异性切割, 并通过聚合酶延伸引入荧光标记dUTP, 最终经核酸外切酶处理及变复性形成单链发夹结构。通过荧光激活细胞分选(FACS), 对靶蛋白孵育后同时具有探针荧光与靶标荧光的微珠进行多轮富集筛选。经高通量测序分析, 成功获得针对白细胞介素-2(IL-2)及人表皮生长因子受体2(HER2)的高性能适体信标。
表征结果显示, 所得IL-2适体信标(如AB-I2、AB-I5)具有纳摩尔级亲和力(Kd = 67 nM及131 nM), 并在结合靶标后表现出显著的荧光恢复效应。其在溶液相检测中展现出宽动态范围(195 pM–800 nM)及低检测限(7.24 pM), 性能与商品化ELISA试剂盒相当, 但无需洗涤步骤。此外, 该信标可有效区分活化与非活化Jurkat细胞, 并对细胞分泌IL-2实现定量分析。值得注意的是, 该适体信标可经转染进入活细胞, 实现细胞内IL-2的实时动态监测。
针对HER2的适体信标(如AB-H10)同样在细胞膜表面及外泌体中展现出良好的特异性与浓度依赖性响应。通过分子动力学模拟, 研究进一步揭示了HER2信标与靶标结合后发生的构象变化及茎环解离机制, 阐明其荧光激活的结构基础。
该平台具有良好的通用性, 可扩展至其他靶标蛋白, 如PD-L1、GPC-3、IFN-γ与TNF。稳定性研究表明, 所选适体信标在生理条件下具备良好的稳定性与较长的半衰期。尽管在亲和力与开关效率的平衡、以及复杂基质中的应用仍面临挑战, 本研究为开发新一代“无洗涤”生物传感探针提供了标准化、高通量的筛选范式, 对推动细胞内实时成像、微流控诊断及蛋白质组学分析具有重要意义。
研究团队指出, 该标准化平台不仅能简化适体信标的筛选流程, 还可大幅提升效率和一致性, 从而推动新一代靶标响应型适体的发展。这些信号开启型(signal-on)适体有望实现复杂环境中的实时检测, 拓展至细胞内成像、微流控分析等领域。此外, 它们在电化学检测、DNA计算等依赖构象切换的检测方式中也展现出潜在价值。未来, 这类高度一致化的信号型探针还可应用于超高通量多重检测(ultra-high multiplexing)和蛋白质组学, 为生命科学研究和先进诊断技术提供新工具。
论文的通讯作者为张力勤研究员, 第一作者为北京大学药学院2023级博士生程璇和2023届长学制毕业生姚盼竹, 北京大学药学院天然药物及仿生药物全国重点实验室为第一单位。该工作获得了国家重点研发计划、国家自然科学基金、海外优秀青年科学基金项目以及北京大学人才引进项目的支持。
论文链接: https://www.nature.com/articles/s41551-025-01503-8
北京大学药学院 天然药物及仿生药物全国重点实验室 供稿
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